实验 病理组织制片技术(示教)

 

一、实验目的

了解病理组织切片的制作过程及要求。

二、实验材料

切片机、HE染液、乙醇、载玻片等。

三、实验内容

病理检验又称病理检查,根据分工不同分为病理诊断和病理检验技术。病理医师主要通过肉眼观察有关组织或器官的形态改变、借助显微镜观察组织结构和细胞形态上的细微变化,结合病理送检单提供的资料,最后做出病理诊断报告的过程,称为病理诊断。要实现对病变组织的显微镜形态学检查,需要将获得的病变组织制成切片。在切片制作过程中所采用的一系列技术,称为病理组织制片技术。病理组织制片技术常规制作方法为石蜡切片法。现将石蜡切片法的基本过程介绍如下:

(一)取材

 按照病理检查的目的和要求,切取适当大小和数量的组织块,用于制作组织切片的过程称为取材。取材准确与否直接关系到制片的质量和病理诊断的正确与否。取材要及时,切取组织块的大小要适当,通常厚度约5px~7.5px,大小以37.5px×37.5px为宜。对于体积小且不易识别的组织,可用伊红染上色后,包裹于绸布或擦镜纸内,以免丢失。

(二)固定

 将取下组织浸入某些化学试剂,使组织细胞所含物质尽量保持在生活状态时的形态结构和位置的过程,称为固定。常用和较理想的固定液为4%中性甲醛溶液。固定要及时,取材后应立即将组织放入固定液中。固定液的量一般为被固定组织体积的10~20倍。

(三)洗涤

用水或乙醇等对固定后的组织进行清洗,把未与组织结合的固定液沉淀物清洗掉的过程,称为洗涤。洗涤的目的是为了去掉未与组织结合的固定液及沉淀物,避免组织中留有较多的固定液而妨碍脱水,或是组织中留有沉淀物影响染色和观察。常用的含水固定液是中性甲醛,用自来水冲洗15~30分钟即可。用乙醇或乙醇混合液固定的组织,一般不需冲洗,可直接进入脱水程序。

(四)脱水

将组织内的水分用某些化学试剂置换出来的过程称为脱水。组织经固定和水洗后,含有大量水分,而水与苯、二甲苯等透明剂不混溶,故组织在透明前必须用能与透明剂相混溶的脱水剂,把组织内的水分置换出来,为下一步的透明做准备。最常用的脱水剂是乙醇。乙醇能硬化组织,可较好地与二甲苯混合。应先从低浓度乙醇开始脱水,逐渐递增其浓度,一般顺序是:80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ。每种浓度乙醇脱水时间为1~2小时。

(五)透明

用某些化学试剂将组织中的脱水剂置换出来,以利于浸蜡和包埋,因组织块浸入这些试剂后常呈半透明状,故称为透明。目的是使石蜡渗入到组织中去,达到包埋的支持作用。二甲苯是最常用的一种透明剂,一般经过二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ两次透明,每次透明时间为20~30分钟。

(六)浸蜡

组织经过透明作用后,放入溶化的石蜡内浸渍,称为浸蜡。组织经过浸蜡后具有一定硬度,有利于切片。一般经石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡Ⅲ,三次更换石蜡,每次浸蜡时间为12小时。石蜡有高熔点和低熔点之分,一般使用的石蜡熔点为58℃。夏季气温较高,可选用熔点为60℃的石蜡。

(七)包埋

先将熔化的石蜡倾入包埋框内,再将浸蜡的组织块用镊子放入包埋框内。包埋好组织的石蜡冷却后形成的固体物,称为组织块或蜡块,组织块具有一定的硬度和韧性,有利于切片。

(八)切片

 将组织块安放在石蜡切片机上切成4~6μm厚的切片,立即将切片放入45℃左右的温水中,使切片伸展于水面上,再将伸展的切片附贴在已清洗好的载玻片上。切片附贴好后放于60℃的温箱内烘烤30~60分钟,就可进行染色。

(九)染色

用染液对组织切片进行处理,使组织中的不同成分被染上相应的颜色,再经过透明,产生不同的折射率,以利于显微镜观察和分析的方法,称为染色。染色法可分为常规染色、特殊染色、组织化学染色、免疫荧光染色等,最常使用的是常规染色法,即苏木素-伊红染色法,简称HE染色。

HE染色步骤如下:

1.脱蜡至水

(1)二甲苯Ⅰ脱蜡5~10分钟

(2)二甲苯Ⅱ脱蜡5~10分钟

(3)无水乙醇1分钟

(4)95%乙醇1分钟

(5)85%乙醇1分钟

(6)自来水冲洗30秒

(7)蒸馏水冲洗30秒

2.苏木素染色

(1)Harris苏木素染色5~10分钟

(2)自来水冲洗30秒

3.分化返蓝

(1)1%盐酸乙醇中分化数秒(眼观紫红色为宜)

(2)自来水冲洗10~15秒

(3)稀氨水蓝化数秒(眼观纯蓝色为宜)

(4)自来水冲洗10~15秒

4.伊红染色

(1)伊红染色10~30秒

(2)自来水分化数秒

5.脱水

(1)85%乙醇脱水30秒

(2)90%乙醇脱水30秒

(3)95%乙醇Ⅰ脱水1分钟

(4)95%乙醇Ⅱ脱水1分钟

(5)无水乙醇Ⅰ脱水2分钟

(6)无水乙醇Ⅱ脱水2分钟

6.透明

(1)二甲苯Ⅰ1分钟

(2)二甲苯Ⅱ1分钟

7.封固  中性树胶封固切片

 染色结果  细胞核、软骨、钙盐、粘液和各种微生物被染成蓝色、深蓝色或灰蓝色。细胞浆呈淡红色,胶原纤维呈淡粉红色,细胞浆内嗜酸性颗粒呈现红色,红细胞呈桔红色。

切片质量  一张优质的HE染色切片应该是组织结构清晰,细胞核与细胞浆蓝红相映,核膜及核染色质颗粒清晰可见,组织或细胞的一般形态结构及很多物质成分均能显示出来,且切片能长期保存(30年),不易褪色。